Variante Crawford Como Causa de Discrepancia en la Tipificación RhD en Banco de Sangre: Reporte de Caso

Sussan Barrera1, Margarita Bolívar1, Ayda Rodríguez1, Adriana Urbina2

1 Banco Nacional de Sangre, Cruz Roja Colombiana, Bogotá, Colombia.
2 Escuela de Medicina y Ciencias de la Salud, Ciencias Biomédicas, Universidad del Rosario, Bogotá, Colombia.

RESUMEN

Se reporta un hombre de 55 años, colombiano, mestizo, quien en su primera donación de plaquetaféresis mostró discrepancia en la tipificación serológica del antígeno RhD. Tras la investigación serológica con múltiples reactivos anti-D monoclonales, tanto IgG como IgM, en diferentes condiciones (22°C y 37°C, en salina y en LISS/Coombs) mostró persistencia de la discrepancia, y la ausencia de reactividad con un panel de anti-D monoclonales no fue compatible con ninguna variante D parcial conocida. El análisis molecular mostró homocigocidad para deleción del gen RHD y heterocigocidad para la variante Crawford (RHCE*ce, RHCE*ceCF), con un fenotipo predicho C-, c+, E-, e+, Vs+, V+. Tras la investigación de este caso, este hombre ha donado plaquetas por aféresis diez veces, y empleando el mismo reactivo anti-D ha presentado reactividad variable con aglutinaciones desde – hasta 2+.

PLABRAS CLAVE:

Sistema del grupo sanguíneo Rh, donantes de sangre, tipificación sanguínea, tipificación serológica.

INTRODUCCIÓN

El sistema Rh ha sido reconocido como uno de los sistemas de grupos sanguíneos más complejos debido a su gran número de antígenos (al menos 45), su inmunogenicidad y la heterogeneidad de sus anticuerpos. Aunque la introducción de dos nomenclaturas Rh diferentes reflejaba las diferencias de opinión con respecto al número de genes que codifican estos antígenos, en la actualidad se acepta que los genes involucrados son RHAG, RHD y RHCE (Shaz, 2009).

Los genes RHD y RHCE se originaron por duplicación génica, por lo cual presentan un alto grado de identidad y difieren entre sí en tan sólo 30 a 35 aminoácidos (Avent & Reid, 2000). Estos genes presentan un importante grado de diversidad, dada por eventos de deleción, conversión génica y mutaciones sin sentido, dando lugar a variantes antigénicas que pueden tener implicaciones clínicas (Avent & Reid, 2000).
Particularmente, algunas variantes codificadas por el gen RHCE pueden llevar a la expresión de algunos epítopes del antígeno RhD (EpD) que reaccionan con ciertos reactivos anti-D monoclonales, agregando una mayor complejidad a la tipificación del antígeno D. Dentro de éstos se destacan la variante ROHar (DHAR, Rh33), encontrada en individuos de ascendencia alemana, y la variante Crawford (ceCF, Rh43), encontrada en individuos de ascendencia africana y también descrita en sujetos colombianos, las cuales merecen especial atención debido a que muestran fuerte reactividad (3+ a 4+) con algunos reactivos monoclonales mientras que no aglutinan con otros (incluida la prueba D débil) dando lugar a discrepancias en la tipificación RhD (Westhoff, 2007).

Las personas con ROHar (Rh33) no tienen un gen RHD, pero presentan dos mutaciones puntuales en el exón 5 del gen RHCE (Q233E y L245V) que conducen a la expresión de algunos epítopes del antígeno D (Ep5 y Ep6/7), lo cual los hace reaccionar con algunos anti-D monoclonales (Beckers et al., 1996). La variante Crawford (ceCF, Rh43) es muy similar a la anterior: tampoco hay un gen RHD y el gen RHCE presenta las mismas dos mutaciones en el exón 5 (Q233E y L245V) descritas en ROHar, motivo por el cual se expresan algunos epítopes del antígeno D y pueden reaccionar con algunos reactivos anti-D monoclonales, así como con anti-D policlonales de ciertos pacientes aloinmunizados; la diferencia es que la variante Crawford presenta además una tercera mutación puntual en el exón 1 del gen RHCE (W16C) (Schlanser & Moulds, MK, 2003; Flegel et al., 2006).

Existen otras dos variantes de RHCE que se caracterizan por mutaciones puntuales que conducen a la expresión de antígenos que “imitan” a algunos epítopes del antígeno D dando lugar a reactividad débil con algunos anti-D monoclonales. Esas son la variante ceRT (RHce R154T) (Wagner et al., 2003) y ceSL (RHce S122L) (Chen et al., 2006). En conjunto, estas cuatro variantes de RHCE (ROHar, ceCF, ceRT y ceSL) tienen en común el hecho de que producen reacciones falsamente positivas con algunos anti-D monoclonales.

Se presenta el caso de un donante de plaquetaféresis de primera vez en quien la tipificación del antígeno RhD mostró discrepancia empleando varios antisueros y en quien los estudios de genotipificación permitieron determinar que es portador del fenotipo Crawford (ceCF, Rh43).

REPORTE DE CASO

Un hombre de 55 años, aparentemente sano, mestizo, natural y residente de la ciudad de Bogotá (Colombia), realizó una donación de plaquetas por aféresis por primera vez el 3 de julio de 2019, en el Banco Nacional de Sangre de la Cruz Roja Colombiana en Bogotá. En el momento de la donación, el banco de sangre se encontraba realizando un estudio de comparación de dos analizadores automatizados de inmunohematología, por lo cual la muestra de este donante fue procesada para las pruebas obligatorias de hemoclasificación ABO + RhD y rastreo de anticuerpos irregulares (RAI), de manera paralela en dos equipos y con diferentes reactivos. Se encontró una discrepancia en la tipificación del antígeno RhD, con resultado negativo (-) en un equipo y positivo débil (+/-, 2+) en el otro. Por lo anterior, se obtuvieron muestras de sangre adicionales del donante y se realizaron análisis serológicos y moleculares suplementarios.

MÉTODOS Y RESULTADOS

Tipificación en banco de sangre

Se realizaron los estudios inmunohematológicos obligatorios para banco de sangre empleando dos plataformas diferentes y de manera paralela, a partir de las mismas muestras de sangre completa en EDTA y de suero. Por un lado, en el analizador IH-1000 (Bio-Rad), con tarjetas de seis columnas, se emplearon: DiaClon® ABO/D+Reverse Grouping for Patients (A: A5, B: G1/2, D: LHM59/20 (LDM3) y 175-2); se utilizó la tarjeta LISS/Coombs para RAI en “pool” y determinación de antígeno D débil a 37°C, C3d (C139-9) con antisuero ID-DiaClon® Anti-D (ESD1); DiaClon® Rh-Subgroups+K (C: MS-24, c: MS-33, E: MS-260, e MS-49, MS-21, MS-63, K: MS-56); e ID-DiaCell® I-II-III e ID-DiaPanel®. Por otro lado, en el analizador Erytra® (Grifols), con tarjetas de ocho columnas, se emplearon: DG Gel® ABO/Rh (2D) (A: 16243 G2 y 16247 E6, B: 9621 A8, AB: 16245 F11 D8, 16247 E6 y 7821 D9, D: P3x61, D´(VI+): P3x290, P3x35, P3x61, P3x21223 B10); Serascan® Diana 2/3; DG Gel Coombs (clon 12011 D10); DG Gel® Rh Pheno+Kell (DVI+: RUM-1 y ESD-1M, C: MS-24, E: DEM-1, c: H-48, e: MS-21, MS-63 y MS-16, Cw: MS-110, K: MS-56); e Identisera® Diana.

La tipificación ABO directa y reversa realizada mostró consistentemente que el donante era grupo A (Figura 1A-B). Sin embargo, se observaron discrepancias en los resultados de la tipificación RhD. En el analizador IH-1000 (Bio-Rad) con un anti-DVI- el resultado fue negativo (Figura 1A). En contraste, en el analizador Erytra (Grifols) el resultado fue positivo débil: con un anti-DVI- se obtuvo resultado 2+ y con un anti-DVI+ el resultado fue +/- (Figura 1B).

Por lo anterior, se realizó determinación del fenotipo Rh y Kell. En las dos plataformas se obtuvo un resultado C-, c+, E-, e+, Kell- (Figuras 1D-C). No obstante, en el equipo Erytra (Grifols), cuyas tarjetas cuentan con ocho columnas, con anti-Cw el resultado fue negativo y con anti-DVI+ se obtuvo un resultado positivo (3+) (Figura 1D). El rastreo de anticuerpos irregulares fue negativo consistentemente en ambas plataformas (Figura 1E-F).

+

Figura 1. A. Tipificación ABO y RhD del donante en su primera donación de plaquetas por aféresis realizada con el equipo IH-1000 (Bio-Rad) empleando un anti-DVI- clonas LHM59/20 (LDM3) y 175-2, y determinación de antígeno D débil a 37°C, C3d (C139-9) con Anti-D (ESD1), con resultado: A RhD negativo. B. Tipificación realizada con el equipo Erytra (Grifols) empleando dos anti-D, uno D de clona P3x61 y D´(VI+) de clonas P3x290, P3x35, P3x61, P3x21223 B10, con resultado: A RhD positivo débil. C. Fenotipo Rh y Kell realizado con el equipo IH-1000 (Bio-Rad) con resultado: C(-), c(4+), E(-), e(4+), K(-). D. Fenotipo Rh y Kell realizado con el equipo Erytra (Grifols) con resultado: C(-), c(4+), E(-), e(4+), Cw(-), K(-), y D(3+) con un anti-D VI+ de clonas RUM-1 y ESD-1M. E. Rastreo de anticuerpos irregulares en “pool” y en fase de LISS/Coombs a 37°C realizada en el equipo IH-1000 (Bio-Rad), resultado: negativo. F. Rastreo de anticuerpos irregulares realizado con el equipo Erytra (Grifols) con células 2/3 en fase de Coombs a 37°C, resultado: negativo. G. Tipificación de RhD parcial realizado con un panel de 6 antisueros anti-D (ID-Partial RhD Typing Set, Bio-Rad) en fase de LISS/Coombs a 37°C, resultado: negativo. H. Tipificación ABO y RhD realizada con el equipo IH-1000 (Bio-Rad) a partir de una donación efectuada 15 semanas después, empleando un anti-D categoría VI- clonas LHM59/20 (LDM3) y 175-2, con resultado: A RhD negativo. con resultado A RhD positivo débil (2+); la determinación de antígeno D débil a 37°C, C3d (C139-9) con Anti-D (ESD1) fue negativa.

Investigación serológica

Ante el hallazgo persistente de discrepancia en la determinación serológica del antígeno RhD empleando diferentes anti-D monoclonales, se realizó la investigación serológica de variantes de RhD parcial empleando un panel de seis anti-D monoclonales, en fase de LISS/Coombs a 37°C (ID-Partial RhD Typing Set, referencia 001451, Bio-Rad), con las clonas LMH76/55 (IgG), LMH77/64 (IgG), LMH70/45 (IgG), LMH59/19 (IgG), LMH169/80 (IgG) y LDM1 (IgM), obteniendo resultados negativos (Figura 1G). Un resumen de la reactividad de los glóbulos rojos del donante con los diferentes reactivos anti-D monoclonales empleados se presenta en la tabla I.

+

Análisis molecular

Se obtuvieron muestras de sangre adicionales, las cuales fueron enviadas a la Universidad Estatal de Campinas (UniCamp; Sao Paulo, Brasil), para el secuenciamiento del gen RHD (wRHD BeadChip® Carrier Phenotype Report, Bioarray Solutions), encontrando deleción completa del gen RHD (exones 1 al 10). Adicionalmente, se enviaron muestras de sangre al Centro de Inmunohematología de Grifols (Grifols IH Center, San Marcos, TX, Estados Unidos) para el secuenciamiento de los genes RHD y RHCE, encontrando homocigocidad para deleción completa de RHD (RHD*deleción, RHD*deleción) y heterocigocidad para la variante Crawford (RHCE*ce, RHCE*ceCF), con tres mutaciones puntuales en el gen RHCE: 48G/C (W16C), 697C/G (Q233E) y 733C/G (L245V), y un fenotipo predicho C-, c+, E-, e+, Vs+, V+.

Comportamiento variable en donaciones posteriores
Después de su primera donación de plaquetas por aféresis, este donante de sangre realizó 10 donaciones entre 2019 y 2020, y en ellas mostró reactividad variable en la hemoclasificación RhD con la plataforma IH-1000 (Bio-Rad) empleando un anti-DVI- LHM59/20 (LDM3) y 175-2, con aglutinaciones desde – a 2+ (Figura 1H); aunque con determinación de antígeno D débil a 37°C, C3d (C139-9) con Anti-D (ESD1) mostrando siempre resultados negativos (Tabla I).

 

DISCUSIÓN

Se reporta un hombre de 55 años, colombiano, mestizo, quien en su primera donación de plaquetaféresis mostró discrepancia en la tipificación serológica del antígeno RhD. Tras la investigación serológica con múltiples reactivos anti-D monoclonales, tanto IgG como IgM, en diferentes condiciones (22°C y 37°C, en salina y en LISS/Coombs) mostró persistencia de la discrepancia y la ausencia de reactividad con un panel de anti-D monoclonales no fue compatible con ninguna variante D parcial conocida. El análisis molecular mostró homocigocidad para deleción del gen RHD y heterocigocidad para la variante Crawford (RHCE*ce, RHCE*ceCF), con un fenotipo predicho C-, c+, E-, e+, Vs+, V+. Tras la investigación de este caso, este hombre ha donado plaquetas por aféresis diez veces, y empleando el mismo reactivo anti-D ha presentado reactividad variable con aglutinaciones desde – hasta 2+.

La variante Crawford (ceCF, Rh43) se caracteriza por un conjunto de tres mutaciones puntuales en el gen RHCE que conducen a la expresión de algunos epítopes específicos del antígeno RhD (EpD). Estas mutaciones son 48G/C (W16C), 697C/G (Q233E) y 733C/G (L245V), que conducen a la expresión del antígeno V, Vs, Ep 6.1, Ep6.2 y EpD16.1 (Flegel et al., 2006). Es justamente la expresión de estos epítopes lo que lleva a una reacción falsamente positiva con algunos anti-D monoclonales, especialmente GAMA401 (IgG), RUM1 (IgM), F5S (IgG), H2D5H2D2 (IgG) y MCAD6 (IgG) (Moulds, MK et al., 2003; Flegel et al., 2006). Debido a esto, algunos de los antisueros que nosotros utilizamos y que contienen RUM1 mostraron reactividad. No obstante, de acuerdo con el listado de reactivos anti-D que se muestra en la tabla I, se observó también reactividad con otras clonas de las cuales no se había informado previamente su capacidad para reconocer la variante Crawford.

La variante Crawford fue descrita inicialmente por Cobb en 1980 (Cobb,ML, 1980) y posteriormente, por Esteban y colaboradores a partir de una mujer gestante colombiana (Esteban, R et al., 2001). No obstante, su caracterización serológica y molecular sólo se realizó años después a partir de series de casos, algunos estadounidenses afrodescendientes y otros colombianos (Schlanser & Moulds, MK, 2003; Flegel et al., 2006). También, se estimó que en Estados Unidos la frecuencia de esta variante podría ser de 0,7% en afrodescendientes RhD negativos o 0,007% en la población general (Flegel et al., 2006). Si bien los reportes disponibles han sido realizados a partir de series de pacientes, este es el primer reporte de variante Crawford en un donante de sangre. Por otro lado, a pesar de que varios de los casos descritos corresponden a colombianos, no tenemos datos disponibles sobre su frecuencia poblacional en Colombia, por lo cual valdría la pena realizar esta estimación.

Aunque se ha sugerido que la variante Crawford, al igual que otras variantes de RHCE como ROHar, ceRT y ceSL, puede tener baja inmunogenicidad debido al número limitado de epítopes del RhD expresados y la posibilidad de un bajo número de proteínas RhCE variantes en la membrana de los glóbulos rojos, la realidad es que el número de determinantes antigénicos por célula no ha sido evaluado en ninguna de estas variantes. En contraste, se han informado al menos dos casos de pacientes portadores de esta variante en quienes se documentó un aloanticuerpo anti-D tras la transfusión de glóbulos rojos RhD positivos (Flegel et al., 2006). Por lo anterior, se recomienda que los sujetos portadores de la variante Crawford sean clasificados como RhD positivos si son donantes de sangre y sean clasificados como RhD negativos para propósitos de transfusión; así mismo, si se trata de una mujer gestante, debe realizarse inmunoprofilaxis anti-D (Rikabi, N et al., 2003; Flegel et al., 2006).

Finalmente, con el fin de aumentar la sensibilidad en la detección del antígeno RhD y sus variantes, se recomienda que en la tipificación Rh para donantes de sangre se empleen reactivos con mezclas de anti-D con distintos isotipos (IgM + IgG) y con la mayor variedad de clonas, incluyendo aquellas para variantes DVI+.

 

CONTRIBUCIÓN DE LOS AUTORES

Sussan Barrera y Margarita Bolívar realizaron la investigación serológica y la remisión de muestras; Sussan Barrera y Adriana Urbina prepararon el manuscrito; Margarita Bolívar y Ayda Rodríguez revisaron el manuscrito.

CONFLICTOS DE INTERÉS

Los autores manifiestan que no tienen conflictos de interés para declarar.

AGRADECIMIENTOS

Agradecemos a Daniel Téllez y Biocientífica LTDA., por su apoyo en la investigación serológica, incluyendo el panel para tipificación de variantes RhD parciales, y por la remisión de muestras a UniCamp (Sao Paulo, Brasil) para análisis molecular del gen RHD; así como a Milena Baquero, Jenny Pedraza y Annar Health Technologies, por proporcionar los reactivos marca Grifols para hemoclasificación ABO y Rh (DG Gel ABO-Rh 2D), fenotipo Rh+Kell (DG Gel Rh Pheno+Kell), rastreo de anticuerpos irregulares y la investigación serológica adicional, por poner a disposición el equipo Erytra (Grifols) y realizar la remisión de las muestras para secuenciamiento de los genes RHD y RHCE al Grifols IH Center (San Marcos, TX, Estados Unidos).

 

REFERENCIAS

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Wagner, F. F., Ladewig, B., & Flegel, W. A. (2003). The RHCE allele ceRT: D epitope 6 expression does not require D-specific amino acids. Transfusion, 43(9), 1248–1254. https://doi.org/10.1046/j.1537-2995.2003.00495.x
Westhoff, C. M. (2007). The Structure and Function of the Rh antigen Complex. Seminars in hematology, 44(1), 42–50. https://doi.org/10.1053/j.seminhematol.2006.09.010